Ротавирусная инфекция: виды возбудителей и диагностика

Автор статьи: 
Александр Буран
Ротавирусные инфекции

Ротавирусы - это особый род вирусов, окруженных оболочкой и имеющих структуру из двух нитей фрагментированной молеулы РНК. Ротавирусы являются возбудителями ротавирусной инфекции. В этой статье мы рассмотрим состав и основные свойства ротавирусов, а также - методы исследования возбудителей.

Основные свойства ротавирусов

VP1

У всех известных ротавирусов VP1 кодируется первым сегментом генома, и это один из трех белков (VP1, VP2 и VP3), которые составляют ядро ротавирусной частицы в соотношении 1:10:1. VP1 относительно гидрофобен, его молекулярный вес равен 124.847 (1088 аминокислот). Он составляет 2% от общей массы вириона, является частью энзиматического комплекса, несет функции вирусной полимеразы, аккумулируется в вироплазме инфицированных клеток и включен в процесс репликации. VP1 способен принимать участие в реакциях иммунопреципитации, иммунофлуоресценции, иммуноблота. При иммунизации VP1, экспрессированном в бакуловирусном векторе, обнаружено, что этот белок является и антигеном, и иммуногеном. Различную способность сывороток реагировать с VP1 после натуральной инфекции или парентеральной иммунизации можно объяснить степенью, до которой VP1 воспринимается иммунной системой организма.

VP2

VP2 кодируется вторым сегментом генома, является основным компонентом ядра с молекулярным весом, равным 102.431 (881 аминокислота), аккумулируется в вироплазме зараженных клеток. VP2 обладает эпитопами, ответственными за субгрупповую специфичность, высокоиммуногенен. Антитела сывороток к этому белку являются хорошим индикатором перенесенной инфекции. VP2 является структурным белком, обладающим, по данным иммуноблота, РНК-связывающей активностью. Он составляет 15% от молекулярной массы вириона и может образовывать вирусоподобные частицы, у которых отсутствует нуклеиновая кислота. Получение таких вирусоподобных частиц чрезвычайно перспективно для использования в целях диагностики и разработки вакцин.

VP3

VP3 кодируется третьим сегментом генома, является структурным компонентом ядра вируса с молекулярным весом, равным 98.120 (835 аминокислот) и составляет 0,5% молекулярной массы вириона. VP3 аккумулируется в вироплазме инфицированных клеток, часто может мигрировать при ЭФ в ПААГ совместно с VP4 и включен в процесс репликации. VP3 наряду с NSP1, NSP2 и NSP4 ассоциируется с вирулентностью.

VP4

VP4 кодируется четвертым сегментом генома, является не-гликозилированным белком внешнего капсида, составляющим 1,5% общего веса вириона, с молекулярной массой, равной 86 762 (776 аминокислот), и обладает рядом важных свойств: гемагглютинирующей способностью (однако не у всех ротавирусов), вирусной инфекционностью, нейтрализирующейся антителами к этому белку, вирулентностью у мышей и патогенностью у человека. VP4 в присутствии трипсина подвергается расщеплению на VP5* и VP8*, проявляющимися в повышении инфекционной активности. VP8* более вариабелен, чем VP5*, т. к. большинство типоспецифических эпитопов VP4 находятся в VP8*. VP5* является более консервативным и содержит в основном перекрестно реагирующие эпитопы.

Показано также, что сборка VP4 предшествует сборке VP7, белка поверхностной оболочки, и что VP4 играет важную роль в распознавании рецепторов и отпочковывании вируса через эндоплазматический ретикулюм в период его созревания. Помимо этого обнаружено, что на VP4 расположены сайты, ответственные за стабильность внешней капсидной оболочки вируса.

VP4 существует в виде мономера (45к), димера (90к)‘и три-мера (135к). Прикрепление и пенетра-ция вируса в чувствительные клетки осуществляется посредством поверхностных шипов, образованных димером VP4, являющимся гемагглютинином. Расщепление VP4 усиливает проникновение (но не связывание) вируса в клетку. VP4 также связан с рестрикцией роста определенных штаммов ротавируса в тканевых культурах и усиливает образование бляшек. Анализ аминокислотных последовательностей позволил определить сайт расщепления трипсином: аргинин 241 и аргинин 247, причем, последняя позиция более предпочтительна. У животных штаммов ротавирусов VP4 состоит из 776 АА, у человека — из 775 АА, поэтому VP8* человеческих штаммов на одну аминокислоту короче. У некоторых штаммов человеческого ротавируса есть дополнительный сайт потенциального расщепления трипсином на лизине или аргинине перед 3' проксимальным сайтом аргинина (246 АА у человеческих штаммов и 247 АА у животных штаммов). Вероятно, дополнительный сайт расщепления связан с вирулентностью, т. к. вирусы с этим дополнительным сайтом были изначально выделены от детей с тяжелой ротавирусной инфекцией.

Изучение нейтрализующих сайтов человеческих ротавирусов Wa и ST3 показало, что их несколько и они связаны с различными аминокислотами. Так, для Wa их два и они ассоциируются с аминокислотами 458 и 392 (гетеро- и гомологичная активность), у ST3 их три: 72, 217, 385. Домены нейтрализации локализованы на VP5* и VP8*.

NSP1 (NS53) является неструктурным белком, который кодируется 5 сегментом генома. Молекулярный вес равен 58 654 (491 АА). Кинетика синтеза полипептидов в клетках, зараженных ротавирусами, показывает, что NSP1 образуется на ранних стадиях после заражения. Синтез этого белка явно находится под контролем, т. к. в инфицированных клетках уровень продуцирования NSP1 ниже по сравнению с другими вирусными белками, в то время как во внеклеточных системах NSP1 синтезируется в количествах, сравнимых с другими вирусными белками. Вероятно, этот белок вовлечен в процесс репликации и сборки генных сегментов РНК, а также ассоциируется с вирулентностью.

VP6 кодируется шестым сегментом генома и является главным структурным белком вирусных частиц. Он образует внутренний капсид вириона, составляя 51% от общей молекулярной массы вируса, и обладает молекулярным весом, равным 44 816 (398 аминокислот). VP6 является тримером, который, выстилая каналы, выступает на поверхность однооболочечных частиц, делая их при электронной микроскопии зубчатыми. Тримериза-ция и образование вирусоподобных частиц, а также формирование тубул при низком pH — все это является неотъемлемыми свойствами белка VP6.

Исследования вирусоподобных частиц ротавирусов

Интересными в этом отношении представляются результаты исследований по характеристике вирусоподобных частиц, получаемых в бакуловирусной экспрессирующей системе. Показано, что более устойчивые вирусоподобные частицы образуются на основе белка VP2. Частицы, формирующиеся при коэкспрессии нескольких генов ротавируса VP2/4 или VP2/4/6, уже были сходны по физико-химическим свойствам с естественным вирусом. Возможность получения таких частиц свидетельствует о том, что каждый из экспрессирующихся вирусных белков обладает свойствами к самосборке и взаимодействию с другими компонентами частицы.

С другой стороны, наличие таких частиц, как VP2/6/7, говорит о том, что VP4 не обязателен в качестве структурного компонента вирусоподобной частицы (Crawford S. Е. et al., 1994). Таким образом, в процессе самосборки VP2 и VP6 формируют пустые двуслойные вирусоподобные частицы, причем на слое, образованном белком VP2, располагается укладка из 260 тримеров VP6. Отмечено, что VP6 принимает участие в транскрипции, является наиболее антигенным и имунногенным и применяется для обнаружения вирусных частиц в ИФА.

VP6 содержит общие перекрестно-активные эпитопы, которыми обладают другие вирусы группы А. Область, ответственная за прикрепление VP6 к ядру, расположена между позициями 58-62. VP6 ответствен за группоспецифическую активность вируса и важен в диагностике.

NSP2

NSP2 (NS35) кодируется сегментами 7, 8 или 9 (в зависимости от штамма вируса), например, SA 11 (сегмент 8), RRV (сегмент 9), UK (сегмент 7). Изучение аминокислотных последовательностей этого белка показывает, что он является основным и ассоциирован с вироплазмой инфицированных клеток. Обнаружено, что NSP2 в процессе вирусного морфогенеза участвует в продуцировании «пустых» вирусных частиц, что подтверждается фактом включения этого белка в репликацию РНК или упаковку ssPHK в субвирусные частицы. NSP2 полиморфен и может присутствовать в инфицированных клетках как в форме мономера, так и димера. Комплекс VP2 и NSP2, вероятно, включает VP3 (Kattoura М. et al., 1994) и ассоциирован с вирулентностью.

NSP3

NSP3 (NS34) кодируется седьмым сегментом генома SA 11, является слабокислым белком и единственным неструктурным белком, который вступает в реакцию вестернблота с радиоактивно меченными антителами. Он обладает молекулярным весом 36 600 (315 АА) и обычно находится в комплексах, изолированных из инфицированных клеток, которые содержат репликаз-ную активность, и в комплексах, которые образуются in vitro в ассоциации с NSP1. NSP3 может быть мультимером, однако чаще димером и, являясь, вероятно, компонентом вирусной репликазы, ассоциирован с цитоскелетоном.

VP7 представляет второй, наиболее крупный белок внешнего капсида, составляющий 30% общей молекулярной массы вириона, и кодируется в зависимости от штамма сегментами 9 (SA 11), 8 (UK) или 7 (RRV). Биохимический анализ выявил, что он является гликопротеином, содержащим только N-связанные оли-госахаридные остатки, присоединяемые котрансляционно. VP7 представляет собой интегрированный белок, включенный в состав мембраны ER, с ориентацией в просвет протока. VP7 высокоиммуногенен и обладает нейтрализационными детерминантами, используемыми в определении серотипов. Его аминокислотная последовательность высокогомологична в пределах серотипа (91-100%), но менее гомологична между серотипами (70-86%). Сравнительный анализ аминокислотных последовательностей VP7 различных штаммов ротавирусов позволил выявить 6 сероспецифических областей, обозначенных буквами от А до F (39-50, 87-101, 120-130, 142-152, 208-221, 233-242). Эти области консервативны только в пределах серотипа и отличаются у разных серотипов.

Дальнейший анализ последовательностей антигенных вариантов VP7 свидетельствует о наличии перекрывающихся серотипоспецифических и серотипоперекрестных эпитопов в антигенной области А и одного типоспецифического эпитопа. Подтверждено наличие антигенной зоны F, расположенной между позициями 235 и 242. Эта область содержит перекрестно-реагирующие эпитопы, не выявляемые при наличии гликозилирования в положении 238, которое влияет на результаты реакции нейтрализации перекрестнореагирующими моноклональными антителами и антигенной области С. Антигенные области А, В, С, и F содержат эпитопы, общие для вирусов типа G, из которых по крайней мере два (С и F) гликозилируются. Отмечено, что регионы В и С очень тесно связаны с серотипом, в то время как регион А гетерологи-чен.

NSP4 (NS28)

Неструктурный гликопротеин с молекулярным весом 20 290 (175 АА), кодируется десятым сегментом генома, синтезируется как первичный трансляционный продукт, котрансляционно гликозилирован. Зрелый гликопротеин является интегральным мембранным белком ER и вовлечен в морфогенез вирусных частиц, которые созревают путем отпочковывания через мембрану ER. Этот протеин содержит 2 КН2-концевых региона с N-связанными олигосахаридами. Изучение топографии NSP4 показало, что NH2-концевые регионы молекул содержатся в мембране, а карбоксидные концы проникают в цитоплазму инфицированных клеток. В ассоциации с NSP1, NSP2 и VP3, NSP4 связан с вирулентностью возбудителя, характеризуется как вирусный энтеротоксин, а также участвует в индукции защитного иммунного ответа и регуляции внутриклеточного уровня Са.

NSP5 и NSP6

NSP5 и NSP6 (NS26) кодируются 11 сегментом генома, и в инфицированных клетках содержится два вирусных белка. Оба белковых продукта, NSP5 и NSP6 (198 АА и 92 АА), аккумулируются в вироплазме. Молекулярная масса NSP5 — 22 кДа, NSP6 — 28 кДа. Этот сегмент генома кодирует малый нейтрализующий антиген и участвует в процессе репликации и генной реассорта-Ции (Estes М. К. et al., 1989). NSP5 играет важную роль в регуляции синтеза ротавирусной РНК.

Ферменты ротавирусов

В составе генома RV содержится фермент, РНК-зависимая РНК-полимераза. Этот фермент участвует в синтезе однонитчатых плюснитевых РНК на матрице минус-нити вирион-ной РНК с образованием информационных РНК и таким образом осуществляет транскрипцию вирусного генома. Полимераза неактивна в составе интактной вирусной частицы и активируется при удалении белков наружного капсида обработкой ЭДТА. В составе RV находятся и другие ферменты, необходимые для образования «шапочки» (cap) на 5 конце информационной РНК.

«Шапочка» является структурой, благодаря которой рибосома узнает информационную РНК. Ферментами, участвующими в синтезе «шапочки», являются гуанидин-трансфераза, метилтрансфераза, нуклео-тид-фосфогидролаза. В составе ротавирусной частицы обнаружена также полиаденилатполимеразная активность, обусловленная ферментом, синтезирующим поли (А) последовательности на 3 конце информационных РНК.



Добавить комментарий

Сейчас комментируют

Надя
У меня после родов была такая боль. Просто роды тяжелые были. Ноющая боль в пояснице у женщин: симптомы и основные причины
Елена
Здравствуйте.Мне 35 лет.Последние 6 лет мучаюсь от странной болезни... Внутричерепное давление: причины и лечение
Татьяна
Соглашусь, что при экземе без мази просто не обойтись, особенно сухой Сухая экзема на ногах: что делать и как лечить?
Лилия
А вот интересно: если боль с позвоночником не связана, от обезболивающ Ноющая боль в пояснице у женщин: симптомы и основные причины